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植物提取物常见的5种检测方法

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2019/01/08
【摘要】:
目前植物提取物的检测方法常见的有五种,分别为:高效液相色谱分析法(HPLC)、紫外吸收光谱分析法(UV)、薄层色谱分析法(TLC)、气相色谱分析法(GC)和原子吸收光谱分析法(AAS)。  每一种方法的作用原理和应用都各不相同。其中,HPLC和UV为标准植物提取物的常用检测方法,TLC被用于比例植物提取物的检测,GC用来检测挥发性液体或油类,AAS用于提取物重金属含量的检测。??  1、高效液相色
 
  目前植物提取物的检测方法常见的有五种,分别为:高效液相色谱分析法(HPLC)、紫外吸收光谱分析法(UV)、薄层色谱分析法(TLC)、气相色谱分析法(GC)和原子吸收光谱分析法(AAS)。
  每一种方法的作用原理和应用都各不相同。其中,HPLC和UV为标准植物提取物的常用检测方法,TLC被用于比例植物提取物的检测,GC用来检测挥发性液体或油类,AAS用于提取物重金属含量的检测。
 
 
  1、高效液相色谱分析法(HPLC)
  HPLC全程是High Performance Liquid Chromatography(高效液相色谱法),又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来,在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
  1.1高效液相色谱分析的流程
  由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,
  而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。
  1.2高效液相色谱的分离过程
  同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
  开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。
  不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。
 
 
  2、紫外吸收光谱分析法(UV)
  UV检测法也是植物提取物常用的检测方法之一,UV是英文名称ultraviolet的缩写,UV检测也称紫外检测法、紫外光谱检测法。UV检测法主要用于配合物组成及其稳定常数的测定,定量分析结构分析定性分析应用范围定义紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁波,由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱当分子中的电子吸收能量后会从基态跃迁到激发态,然后放出能量(辐射出特征谱线),回到基态;而辐射出特征普线的波长在紫外区中就叫做紫外光谱(UV)
  紫外光来自于一个水银紫外灯,水银紫外灯是通过蓝宝石窗口以及过程流来获取的。除了特定的紫外波长,狭窄的波段通过紫外过滤器阻塞了所有的传输光线。这些紫外光能够通过过滤器以及测试探测器只记录特定的紫外波长。
  紫外光直接通过靠近灯的相同规格的紫外过滤器。参考探测器置于过滤器后边,可以测试出当前的紫外强度。参考探测器信号用于弥补由于灯管老化,极端温度变化等引起的紫外资源强度的起伏变化。通过测量及参考探测器给到的光电流结果将会通过传送器进行放大,修改,处理。传送器实时的提供经计算后的测量结果,且能够向处理控制系统发送多个输出值。
  2.1 UV定性分析
  在有机化合物的定性分析中,紫外-可见光谱适用于不饱和有机化合物,尤其是共轭体系的鉴定,以此推断未知物的骨架结构。此外,可配合红外光谱、核磁共振波谱法和质谱法进行定性鉴定和结构分析,因此它仍不失为是一种有用的辅助方法。一般有两种定性分析方法,比较吸收光谱曲线和用经验规则计算最大吸收波长λmax,然后与实测值进行比较。结构分析??结构分析可用来确定化合物的构型和构象。如辨别顺反异构体和互变异构体。
  2.2 UV定量分析
  紫外-可见分光光度定量分析的依据是Lambert-Beer定律,即在一定波长处被测定物质的吸光度与它的溶度呈线性关系。应此,通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度可求出该物质在溶液中的浓度和含量。种常用的测定方法有:单组分定量法、多组分定量法、双波长法、示差分光光度法和导数光谱法等。配合物组成及其稳定常数的测定??测量配合物组成的常用方法有两种:摩尔比法(又称饱和法)和等摩尔连续变化法(又称Job法)。酸碱离解常数的测定??光度法是测定分析化学中应用的指示剂或显色剂离解常数的常用方法,该法特别适用于溶解度较小的弱酸或弱碱。
 
 
  3、薄层色谱分析法(TLC)
  薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示,又称薄层层析,属于固-液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克,甚至0.01μg)的分离;另一方面若在制作薄层板时,把吸附层加厚,将样品点成一条线,则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外,在进行化学反应时,常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
  薄层色谱是在被洗涤干净的玻板(10×3cm左右)上均匀的涂一层吸附剂或支持剂,带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上,凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内,浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时,将色谱板取出,干燥后喷以显色剂,或在紫外灯下显色。薄层色谱又叫薄板层析,是色谱法中的一种,是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术,属固—液吸附色谱,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点,一方面适用于少量样品(几到几微克,甚至0.01微克)的分离;另一方面在制作薄层板时,把吸附层加厚加大,因此,又可用来精制样品,此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外,薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
 
 
  4、气相色谱分析法(GC)
  GC:Gas Chromatography气相色谱法用气体作为移动相的色谱法。根据所用固定相的不同可分为两类:固定相是固体的,称为气固色谱法;固定相是液体的则称为气液色谱法。
  气相色谱系统由盛在管柱内的吸附剂,或惰性固体上涂着液体的固定相和不断通过管柱的气体的流动相组成。将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后,由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同,即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别,当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时,各组分沿管柱运动的速度就不同,分配系数小的组分被固定相滞留的时间短,能较快地从色谱柱末端流出。以各组分从柱末端流出的浓度c对进样后的时间t作图,得到的图称为色谱图。当色谱过程为冲洗法方式时,组分在进样后至其最大浓度流出色谱柱时所需的保留时间tR,与组分通过色谱柱空间的时间tM,及组分在柱中被滞留的调整保留时间t恼的关系是:
  式中t恼与tM的比值表示组分在固定相比在移动相中滞留时间长多少倍,称为容量因子k:
  从色谱图还可以看到,从柱后流出的色谱峰不是矩形,而是一条近似高斯分布的曲线,这是由于组分在色谱柱中移动时,存在着涡流扩散、纵向扩散和传质阻力等因素,因而造成区域扩张。在色谱柱内固定相有两种存放方式,一种是柱内盛放颗粒状吸附剂,或盛放涂敷有固定液的惰性固体颗粒〔载体或称担体(表2)〕;另一种是把固定液涂敷或化学交联于毛细管柱的内壁。用前一种方法制备的色谱柱称为填充色谱柱,后一种方法制备的色谱柱称为毛细管色谱柱(或称开管柱)。
  通常借用蒸馏法的塔片概念来表示色谱柱的效能,例如使用“相当于一个理论塔片的高度“H或“塔片数”n来表示柱效。对于填充柱:
  对于开管柱:
  式中λ是与填充均匀性有关的因素,称为填充不规则因子;γ是柱内填充物使得气体扩散路径弯曲的因素,称为弯曲因子;dp是填充物平均颗粒直径(即粒度);u是载气在柱温、柱压下的线速;Dg是组分在气相中的分子扩散系数;Dl是组分在液相的扩散系数;df是固定液的液膜厚度;dc是开管柱的内径。所以色谱柱的塔片数n=L/H,式中L为色谱柱长;n的数值可用给定的物质作实验,由实验所得到的色谱图(图1)计算得到:
  式中ω┩为色谱峰的半高宽,由于气相色谱的组分在固定液中的分配等温线多为线性,如果进样量很小,得到的色谱峰流出曲线最初是用高斯正态分布来描述的,其数学表示式为:
  现在实验和理论上都证明了物质的色谱峰形状是不对称的和曳尾的,若用指数衰减修正的高斯分布作为描述色谱峰形状的分布函数,则更为确切:
  式中A表示峰面积;tG表示高斯峰的中心位置;σ表示高斯峰的标准方差;τ表示指数衰减函数的时间常数;t′为积分变量。
  上面曾经指出,两组分的分配系数必须有差异,其色谱峰才能被分开。有了差异,分离时所需的柱效n也就不相同,所以要判别两色谱峰分离的情况(图2),还需要采用色谱柱总分离效能指标R:
  n与R的关系为:
  式中α′是组分相对保留值;α是组分校正相对保留值。从上式可知,选择适宜固定液和具有给定塔片数的色谱柱后,应该通过改变色谱柱温来调节α′值,从而满足将两组分分离至给定R值的分离程度。
 
 
  5、原子吸收光谱法(AAS)
  原子吸收光谱法(AAS),全称是Atomic Absorption Spectrometry
  AAS基本原理:
  每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征谱线,也可以吸收与发射线波原子吸收光谱原理图
  长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时,即入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态(一般情况下都是第一激发态)所需要的能量频率时,原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线,使入射光减弱。特征谱线因吸收而减弱的程度称吸光度A,与被测元素的含量成正比:式中K为常数;C为试样浓度;I0v为原始光源强度;Iv为吸收后特征谱线的强度。按上式可从所测未知试样的吸光度,对照着已知浓度的标准系列曲线进行定量分析。由于原子能级是量子化的,因此,在所有的情况下,原子对辐射的吸收都是有选择性的。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同,元素从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同,因而各元素的共振吸收线具有不同的特征。原子吸收光谱位于光谱的紫外区和可见区。
 
 
 
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